J Exp Med：依赖型单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC线粒体代谢

生物心脏病表现借助于有力而复杂的叶绿体新陈代谢，似乎是由呼吸系统一个组织的高氧开放性遭受的。由于活开放性氧(ROS)的分解是这种新陈代谢的副副产品，因此需以烟酯丝氨酸二核苷酯磷酯(NADPH)的表现形式来下降肝细胞死亡，以应对这种叶绿体活开放性的加强。烟酯单核苷酯核糖(NNT)可通过NADPH的分解来延续叶绿体的抗癌控制能力，但其在非小肝细胞心脏病(NSCLC)当中的起到尚未明确。本归纳挖掘出NNT的表达借助于来在心脏病动物基本概念基本概念当中微小加强了的转变成和侵袭开放性。另以外，全面性归纳挖掘出NNT纠正亦会造成了叶绿体机制障碍，这与肝细胞死亡的大量减少牵涉到，而是以铁硫肝细胞内的活开放性下降为标记。这些有缺陷与NADPH的有效开放性和ROS的积攒有关，这指借助于NNT在加大这些不可或缺肝细胞内金属离子的降解当中起着不可或缺起到。

实验设计

许多常见的心脏病动物基本概念基本概念是并用C57BL6/J动物基本概念的饲养策略而构建。有趣的是，这些动物基本概念携带纯合以外显子7-11的窗格纠正以及叶绿体当中Nnt基因序列的错义性状造成了非机制肝细胞内的表达借助于来。因此，可以并用这种自然纠正的等位基因(NntΔex7-11)来评价NNT对心脏病再次发生的严重影响。

首先，适用Kras性状(LSL-KrasG12D/+)激起的心脏病基本概念来检测Nnt表达借助于来对心脏病再次发生的严重影响。携带Cre重新组建酵素的腺免疫有缺陷LSL-KrasG12D/+动物基本概念，可可借KrasG12D在呼吸系统上皮当中的表达借助于来和呼吸系统脑瘤的转变成。并用LSL-KrasG12D/+动物基本概念和C57BL6/J动物基本概念受精造成了Nnt+/+表达借助于来动物基本概念或NntΔex7-11/Δex7-11表达借助于来动物基本概念(三幅1A-1B)。该基本概念当中Nnt的表达借助于来造成了Cre重新组建酵素所致的负荷加快3个月(三幅1C-1D)。然后，并用Kras性状与p53纠正同时表达借助于来(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)构建心脏病基本概念。Nnt的表达借助于来无法忽略Cre可借的KP动物基本概念的存活率(三幅1E)。有趣的是，在这个基本概念当中，p53的纠正消除了Nnt表达借助于来对心脏病转变成的严重影响，并且无论Nnt表达借助于来如何，实验再一都长期存在微小的负荷(三幅1F)。心脏病负荷比例的量化在不同表型动物基本概念彼此间无法差异性(三幅1G-1H)。

虽然不同表型动物基本概念彼此间的负荷无法差异性，但确实检视到基本概念当中侵袭开放性的差异性。我们挖掘出Nnt+/+动物基本概念当中51.3%的为3级(脑瘤)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11动物基本概念当中仅剩36.5%和38.8%的是文职(三幅1I)。Nnt+/+动物基本概念再次发生4级的频率总体减少，证明了侵袭开放性的叠加(三幅1J)。总之，这些数据集指借助于Nnt促成了心脏病的再次发生和侵袭。

2 NNT的纠正不严重影响叶绿体当中硫氧还肝细胞内(TXN)的抗癌法制

为了全面性评量NNT对心脏病生物学的严重影响，首先评量shRNA分心NNT肝细胞内的表达借助于来，包括4个表达借助于来NNT肝细胞内的NSCLC肝细胞系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表达借助于来NNT肝细胞内的H441肝细胞(三幅2A)。分心NNT肝细胞内表达借助于来可抑制NSCLC肝细胞的裂解控制能力(三幅2B)。并且挖掘出快免疫有缺陷4当晚NNT的大幅降低下降了H2009和PC9肝细胞的生存控制能力(三幅2C)。此以外，H441肝细胞的裂解不受NNT的严重影响。

上会并不认为NNT最大限度NADPH的转化成控制能力，从而延续叶绿体肝细胞内抗癌种系统始终保持转化成稳定状态(三幅2D)。分心NNT下降了H1299、H2009和PC9肝细胞当中NADPH: NADP+的比例 (三幅2E)。快免疫有缺陷4当晚叶绿体当中H2O2总体减少(三幅2F)，所以NNT对H2O2药处理过程很最主要。

为了确切这些叶绿体ROS的减少确实与叶绿体抗癌种系统有关，于是并用Western blotting评量叶绿体当中过降解物肝细胞内3(PRDX3)的降解稳定状态。H2O2通过PRDX3药，即一对半胱氨酯残基可借PRDX3转变成二聚体，并且必须通过TXN转化成这些半胱氨酯残基才能转化成PRDX3的抗癌机制。PRDX3二聚体的积攒是PRDX3降解的标记，是叶绿体肝细胞死亡的常用标记物。

奥拉姆芬是一种TXN转化成酵素(TRXR)可抑制剂，虽然奥拉姆芬的用药亦会造成了PRDX3肝细胞内大量降解，但NNT的纠正并无法减少PRDX3的降解(三幅2G)。此以外，NNT的纠正也无法下降叶绿体TXN2或TRXR2的肝细胞内高度。总之，这些结果指借助于NNT在NSCLC肝细胞裂解控制能力上起着最主要起到，但NNT活开放性的丧失并不亦会伤害叶绿体TXN抗癌种系统，也不亦会激起微小的肝细胞死亡。

3 NNT的纠正亦会伤害叶绿体的降解控制能力

鉴于NNT在IMM当中的定位及其严重影响薄膜上质子辐射能和转化成控制能力，于是试三幅探讨NNT对叶绿体降解新陈代谢确实最主要。首先，适用海马肝细胞以外辐射能归纳仪展开叶绿体压力测试，评量NNT纠正对一般叶绿体降解机制的严重影响。结果挖掘出NNT纠正肝细胞的耗氧量(OCR) 随叶绿体可抑制剂的依次传送而被下降(三幅3A)。值得注意的是，NNT纠正肝细胞的最大换气控制能力在不依赖于非耦合换气的情况下总体下降(三幅3B)。这提示叶绿体降解有缺陷与NNT对质子发散的严重影响牵涉到。鉴于NNT纠正微小严重影响换气控制能力，于是检测NNT纠正的H441肝细胞确实比NNT表达借助于来肝细胞具有更少的降解和更强的糖酵解控制能力。这说明这些肝细胞在无法NNT的情况下似乎通过叶绿体NADPH比如说而延续叶绿体的机制。

叶绿体的降解新陈代谢依赖于ETC的机制，ETC由介导电子传送的Fe-S肝细胞内亚基都是由。考虑到Fe-S肝细胞内亚基的酪氨酸处理过程需NADPH，于是归纳NNT分心后叶绿体换气机制的上升确实与Fe-S肝细胞内比如说。叶绿体压力测试可以对换气机制展开一般开放性的归纳，但不可以对单个ETC亚基成分展开评量。因此，译者展开了非常专业的实验来归纳Fe-S肝细胞内依赖的换气比如说亚基(I, II, III)。结果挖掘出，基于亚基I(酯和苹果酯)的摄取，在NNT分心后亚基I-III的活开放性总体下降(三幅3C)。此以外，NNT有缺陷肝细胞微小下降了琥珀酯的OCR，指借助于下降了琥珀酯脱氢酵素(SDH)活开放性和亚基II-III输水(三幅3D)。造成了这一现象的最主要原因是SDH在ETC和TCA气化当中必不可少双重角色。

除了通过ETC延续电子输水以外，Fe-S肝细胞内还延续对降解新陈代谢至关最主要的其他肝细胞内酵素的机制。为了确切NNT确实参加其他Fe-S肝细胞内的机制，译者评量了TCA气化当中Fe-S肝细胞内——顺乌头酯酵素(ACO2)的活开放性。结果挖掘出分心NNT总体下降了NSCLC肝细胞系当中ACO2的活开放性(三幅3E)。ACO2活开放性的下降似乎亦会严重破坏TCA气化，进而下降驱动ETC输水的转化成开放性物质的分解。为了补充非小肝细胞心脏病当中ACO2机制的归纳，于是评价Nnt表达借助于来对KP心脏病当中ACO2活开放性的严重影响。结果指借助于，Nnt+/+动物基本概念当中Aco2活开放性微小大于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11当中的，缺乏Nnt的表现借助于最低的活开放性(三幅3F)。

4 以外源开放性NADPH在NNT纠正后延续Fe-S肝细胞内机制

为了确切与分心NNT比如说的叶绿体Fe-S肝细胞内机制的下降确实与NADPH:NADP+的下降有关，我们试三幅提供一种叶绿体NADPH的以外源开放性比如说。为了实现这一最终目标，我们选择了糖类叶绿体当中NADH激酵素pos5p，它可以磷酯化NADH而造成了NADPH。虽然pos5p以前在细菌当中也有以外源表达借助于来，但据我们所知，pos5p还无法被应运而生两栖类种系统。为了检测我们确实需有效地在生物NSCLC肝细胞的叶绿体当中表达借助于来pos5p肝细胞内，我们对糖类肝细胞内展开了修饰，使其值得注意HA-tag。Western blot得借助于，在H1299、H2009和PC9肝细胞的叶绿体当中成功表达借助于来了HA-tag标记的pos5p肝细胞内(三幅4A)。选择这些肝细胞系是为了评量pos5p修复和NNT纠正比如说的Fe-S肝细胞内有缺陷的控制能力，挖掘出分心NNT后对它们遭受很严重的严重影响。

pos5p的表达借助于来力挽狂澜了肝细胞当中分心NNT后激起的NADPH: NADP+比例的下降(三幅4B)。这与表达借助于来pos5p肝细胞当中pos5p扰后换气多肽复杂社交活动的下降有关(三幅4C和4D)。此以外，pos5p的表达借助于来完全力挽狂澜了NNT分心后ACO2活开放性的上升(三幅4E)。总之，这些数据集指借助于延续NNT表达借助于来纠正时NADPH的高度可以受保护NSCLC肝细胞当中Fe-S肝细胞内的机制。

5 NNT的纠正不亦会严重破坏Fe-S肝细胞内的酪氨酸

考虑到叶绿体以外源开放性NADPH需逼近NNT纠正比如说Fe-S肝细胞内的有缺陷，并且NADPH是高效延续Fe-S肝细胞内酪氨酸的必备条件，因此我们接下来试三幅确切NNT活开放性确实延续这一处理过程。Fe-S肝细胞内酪氨酸再次发生在一个由半胱氨酯二氧化硫酵素(NFS1)和Fe-S支架肝细胞内(ISCU)都是由的多肝细胞内亚基当中。亚基当中任何一种成分的纠正都亦会严重影响酪氨酸，并且也与叶绿体有缺陷比如说。因此，我们分心NFS1或ISCU表达借助于来来归纳严重破坏Fe-S肝细胞内酪氨酸后对换气多肽和ACO2的严重影响。

在H2009肝细胞当中，分心NFS1后总体下降酯/苹果酯重排和琥珀酯重排当中换气多肽亚基I-III的活开放性，而在PC9肝细胞当中只有亚基II-III活开放性被微小下降(三幅5A和5B)。另以外，两个肝细胞系当中，在酯/苹果酯和琥珀酯的起到下，分心ISCU表达借助于来后总体逼近了OCR(三幅5A和5B)。并且分心NFS1或ISCU后总体下降了肝细胞系当中ACO2活开放性(三幅5C)。有趣的是，NNT分心后所激起的有缺陷与Fe-S肝细胞内酪氨酸所需物质遭受的有缺陷是同等最主要的(三幅5A-5C)。

为了证明Fe-S肝细胞内有缺陷对NSCLC肝细胞的叶绿体新陈代谢有机制开放性严重影响，我们对分心NNT或ISCU肝细胞展开基于气相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的新陈代谢组学归纳。 对这些肝细胞TCA气化的新陈一降解氮展开归纳，得借助于大多数尾端副产品的丰度再次发生了总体叠加(三幅5D)。这些都指借助于了降解新陈代谢的严重严重破坏和Fe-S肝细胞内机制有缺陷的一致开放性。具体地说就是分心NNT和ISCU表达借助于来后，酯、苹果酯和富马酯被消耗。NNT纠正肝细胞当中的柠檬酯高度被耗尽，但分心ISCU肝细胞当中并无法此结果。另以外，分心ISCU肝细胞当中琥珀酯大量积攒，而在NNT纠正肝细胞当中则不长期存在此现象(三幅5D)。

除了Fe-S肝细胞内ACO2和SDH以外，TCA气化还依赖于另一种叶绿体Fe-S肝细胞内——胺类酯制备酵素(LIAS)的机制。LIAS对于胺类酯的制备以及最主要胺类酯卤底物的顺式都非常不可或缺，胺类酯卤底物由PDH (E2)和α-衍生物戊二酯脱氢酵素(二氢胺类酯S-琥珀酰核糖，DLST)都是由。LIAS对Fe-S肝细胞内酪氨酸的严重破坏比如说尖锐，因为其Fe-S簇在催化处理过程当中被消耗掉，这就促请不断地展开肝细胞内交换。事实上，分心NFS1和ISCU表达借助于来亦会大量下降PC9肝细胞当中PDH-E2和DLST的脂化，然而分心NNT对肝细胞内脂化无严重影响(三幅5E)。总的来说，这些数据集指借助于，NNT导致酵素和新陈代谢有缺陷，它们的有缺陷与Fe-S肝细胞内酪氨酸的严重破坏比如说，但NNT不似乎直接严重影响这一处理过程。这反映借助于分心NNT和ISCU后对TCA气化造成了类似但又不同的严重影响。

6 NNT的纠正严重破坏人体内酯新陈代谢

除了消耗TCA气化以外，NNT有缺陷肝细胞的LC-HRMS新陈代谢组学归纳指借助于人体内酯新陈代谢失调。分心NNT促成长多肽人体内酰基甲壳素的大量积攒，而长多肽人体内酰基甲壳素是人体内酯β-降解的丝氨酸(三幅6A)。鉴于在NNT有缺陷肝细胞当中长期存在换气种系统有缺陷，我们表明这些酰基甲壳素的减少是由于人体内酯降解下降。我们挖掘出在H1299和PC9肝细胞当中OCR与橄榄酯卤的降解有关，分心NNT后OCR下降(三幅6B)。我们还检视到NNT有缺陷肝细胞当中饱和人体内酯和不饱和人体内酯均大量积攒(三幅6C)。人体内酯制备需消耗大量NADPH，而且NNT分心后NADPH的有效开放性下降，于是我们并不认为这些人体内酯高度的减少是由于以外源开放性人体内酯摄入量的减少。另以外，我们挖掘出，NNT有缺陷肝细胞加强了对红以外橄榄酯小分子的吸收控制能力(三幅6D)。为了评价NNT分心后人体内酯的积攒确实是一个潜在的不利因素，我们适用饱和人体内酯橄榄酯酯刺激NNT有缺陷肝细胞24天内，挖掘出NNT分心后使H1299和H2009肝细胞对橄榄酯卤尖锐(三幅6E)。此以外，NNT分心后总体降低了H1299和PC9肝细胞对单独不饱和人体内酯油酯卤的尖锐开放性(三幅6F)。鉴于以外源开放性人体内酯补充的有害严重影响，我们预计肝细胞以外人体内消耗将受保护NNT的纠正。令人困惑的是，微生物当中的人体内消耗加剧了NNT的大幅降低(三幅6G)。更最主要的是，NNT分心后肝细胞以外人体内缺乏亦会减少NADPH的消耗(三幅6H)，这指借助于在缺乏以外源开放性人体内酯的情况下被迫制备人体内酯，使NNT有缺陷肝细胞当中NADPH的有效开放性下降。总的来说，这些数据集指借助于NNT似乎在调节人体内酯新陈代谢当中起最主要起到，NSCLC肝细胞的人体内酯新陈代谢紊乱似乎是一个可并用的弱点。

7 NNT纠正后叶绿体基因表达甲醛酵素(MitoCatalase)力挽狂澜Fe-S肝细胞内机制

Fe-S肝细胞内对大分子氧和更多有害物质的降解非常尖锐。虽然我们无法检视到叶绿体肝细胞内抗癌种系统的降解稳定状态再次发生叠加，但这并不也就是说NNT分心后导致的叶绿体ROS足够将这些尖锐开放性金属离子降解。为了探究这种似乎开放性，我们适用了叶绿体基因表达的甲醛酵素(MitoCatalase)来加强叶绿体的抗癌控制能力。我们成功地在H1299、H2009和PC9肝细胞当中过表达借助于来了MitoCatalase (三幅7A)。MitoCatalase的表达借助于来也大多逼近了NNT分心后比如说叶绿体当中H2O2的造成了(三幅7B)。这与NNT分心后换气多肽复杂社交活动的下降相对应(三幅7C和7D)。另以外，MitoCatalase的表达借助于来恢复NNT分心后ACO2的活开放性(三幅7E)。综上所述，这些数据集指借助于，降低叶绿体药H2O2的控制能力可以避免NNT分心后Fe-S肝细胞内再次发生有缺陷，从而使NNT在避免Fe-S肝细胞内再次发生降解方面起着起到，但对Fe-S簇的酪氨酸无起到。

结论

总之，我们的归纳指借助于，NNT对心脏病生物学具有最主要意义，主要是通过调控Fe-S肝细胞内而促成叶绿体新陈代谢。与以往评价NNT机制的归纳不同，我们描述了NNT对NSCLC当中叶绿体降解转化成稳态的微妙严重影响。在NSCLC当中，NNT活开放性似乎加大了大量降解新陈代谢激起的肝细胞死亡重排。我们的挖掘出全面性指借助于了叶绿体新陈代谢在心脏病再次发生当中的必要开放性，说明叶绿体机制的加强似乎是心脏病用药的一个最主要机理。酵素TPH-1对肾受保护起不可或缺起到，似乎作为用药CKD的潜在用药机理。

原始借助于处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.